Allumer et éteindre les protéines : une nouvelle lumière sur la cellule végétale
Pour suivre une protéine dans une cellule vivante, les biologistes lui accrochent une étiquette lumineuse, le plus souvent la GFP (Green Fluorescent Protein), une protéine de méduse qui fluoresce en vert quand on l’éclaire. Des chercheurs du BIAM et leurs partenaires montrent qu’une alternative, baptisée FAST, fonctionne chez les plantes.
Plus petite, plus brillante et plus résistante, elle a un atout rare : sa lumière s’allume et s’éteint à la demande. Ces travaux sont publiés dans The Plant Journal.
Pourquoi rendre les protéines lumineuses ?
Les protéines sont les ouvrières de la cellule, mais elles sont trop petites pour être vues au microscope. Leur accrocher une étiquette fluorescente revient à leur poser une balise: on peut ainsi les localiser dans la cellule voir même mettre en évidence leurs interactions avec d’autres protéines. Par le passé, les technologies histologiques de colorations imposaient de tuer la cellule. Les étiquettes fluorescentes permettent de l’observer vivante et de suivre leur évolution dans le temps : c’est la différence entre une photo et un film.
Une étiquette en deux morceaux
Les protéines FAST ont été mises au point par l’équipe d’Arnaud Gautier (Laboratoire des biomolécules, Paris) à partir d’une protéine de bactérie. Elles fonctionnent en duo : une petite protéine, deux fois plus petite que la GFP, attachée à la protéine étudiée, et une molécule apportée de l’extérieur, le fluorogène. Ce dernier, per se, ne brille presque pas. Associé à la FAST, il s’illumine. Ajouter le fluorogène à l’échantillon permet d’illuminer la FAST; tandis qu’un rinçage supprime le signal.
Éprouvé chez les bactéries, les levures et les animaux, le système restait à tester chez les plantes.
Ça marche chez l’arabette
Les chercheurs ont créé des arabettes des dames (Arabidopsis thaliana), plante modèle des laboratoires, produisant une version verte (Green-FAST) ou rouge (Red-FAST) de la protéine. Baignées dans le fluorogène, les racines s’illuminent en quelques secondes, jusque dans leurs cellules profondes. Tiges et feuilles demandent plus de temps d’incubation (une demi-heure), sans doute freinées par leur transport de la racine aux parties aériennes. Le fluorogène ne perturbe pas la croissance, et un rinçage de 5 à 15 minutes éteint le signal.
Plus brillantes, plus endurantes
Dans les mêmes conditions, la Green-FAST brille environ 2,4 fois plus fort que la GFP, et la Red-FAST 1,4 fois plus. Sous le microscope, Green-FAST met quatre fois plus de temps que la GFP à perdre la moitié de son éclat. Red-FAST surpasse aussi nettement mCherry, le marqueur rouge de référence. Après fixation ou en milieu acide, les FAST restent visibles là où la GFP s’efface.
Une balise pour chaque destination dans la cellule
L’équipe a accroché diverses FAST à des protéines végétales connues pour être adressées dans des compartiments cellulaires distinct chez l’arabette et dans des feuilles de tabac. Ceci a permis de marquer des compartiments aussi divers que: la membrane de la cellule pour un transporteur de phosphate, le noyau pour deux régulateurs de gènes, mais aussi les mitochondries (centrales énergétiques), les peroxysomes et les chloroplastes (siège de la photosynthèse). Les FAST et leurs fluorogènes associés se révèlent des marqueurs fiables.
Visualiser les interactions entre protéines
Une variante, la Split-FAST, utilise un FAST coupée en deux morceaux, chacun greffé à une protéine différente. Si les deux protéines s’associent, on reconstitue la FAST ce qui permet en présence du fluorogène de récupérer du signal fluorescent. Ceci a été testé sur un couple connu : une protéine sensible au calcium et une enzyme destinée au chloroplaste. Résultat : une lumière nette là où le couple se forme. Avec une enzyme modifiée, incapable de s’associer : rien. Cerise sur le gâteau cette protéine FAST accepte différents fluorogènes, permettant un signal vert, jaune ou rouge.
Ce que ça apporte
Les biologistes des plantes disposent maintenant d’un outil complémentaire à la GFP : moins encombrant, plus lumineux, plus endurant, utilisable sur échantillons fixés. L’interrupteur distingue le vrai signal du bruit de fond, en comparant la cellule avant et après ajout du fluorogène. On peut, en outre, faire varier les couleurs si l’on doit l’associer à d’autres marqueurs.
Et maintenant ?
Contrairement à son équivalent issu de la GFP, qui reste soudé, le Split-FAST peut se dissocier. On pourrait donc filmer des protéines qui s’associent puis se séparent accédant ainsi à leur dynamique: c’est la prochaine étape. Reste aussi à tester FAST dans les compartiments très acides, comme la vacuole.