Offre de compétences et équipements

Responsable : Bertrand Légeret (IEHC CNRS)

HelioBiotec possède tout l’équipement nécessaire à l’analyse des lipides de microalgues (glycérolipides membranaires ou de stockage) ainsi que d’autres types de lipides (hydrocarbures, pigments, polyesters lipidiques et cires de plantes).

Types de lipides analysés
  • Glycérolipides: phospholipides, galactolipides, sulfolipides, mono-, di- et tri-acylglycérols, bétaïne lipides.
  • Acides gras : espèces courantes et inhabituelles
  • Composants des cires cuticulaires de plantes : alcanes, alcools primaires et secondaires, aldéhydes, cétones, monoesters, etc.
  • Monomères des polyesters de cutine et subérine: acides gras hydroxylés, acides gras époxidés, acides gras dicarboxyliques, etc.
  • Hydrocarbures : alcanes et alcènes
  • Pigments : chlorophylles, caroténoïdes.
Equipements analytiques :
  • Chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse et/ou à un détecteur par ionisation de flamme (GC-MS/FID) : 1 GC-MS (TRACE-DSQ Thermo), 1 GC-MS/FID avec préparation automatique des échantillons (Agilent), 1 GC-MS/FID (Agilent) avec thermodésorbeur (Gerstel).
  • Chromatographie sur couche mince haute performance (HPTLC) : 1 Camag TLC autosampler 4
  • Chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS/MS) : 1 QTOF (Triple TOF 5600 AB SCIEX), 1 Orbitrap (Q Exactive Thermo).
Analyse des glycérolipides :
  • Les différents types d’analyse

  • Profil d’acides gras (par GC-MS/FID)

© B. Légeret / CEA

  • Classes de lipides (par HPTLC)

© C. Cuiné / CEA

  • Espèces moléculaires (par UPLC-MS/MS haute résolution : lipidomique)

La plateforme HélioBiotec est équipée de deux spectromètres de masse dédiés à l’analyse de gaz d’intérêt biologique et plus spécialement de l’oxygène, de l’hydrogène, et du dioxyde de carbone

La spectrométrie de masse permet de suivre en temps réel la composition de l’atmosphère (gazeuse ou dissoute) au contact d’un échantillon biologique : cellules vivantes (microalgues, bactéries, cellules isolées…) ou extrait enzymatique. Cette technique est utilisée pour caractériser les échanges photosynthétiques d’oxygène ou de gaz carbonique ou les processus de photo-production d’hydrogène chez des microalgues ou des cyanobactéries. Elle permet via le suivi d’espèces gazeuses marquées par des isotopes stables de déterminer les flux unidirectionnels (prise d’oxygène à la lumière).

Les gaz dissous contenus dans la cellule d’analyse (volume utile de l’ordre de 2 mL) diffusent au travers d’une membrane en téflon, puis transitent via une ligne de vide jusqu’à la source d’ions du spectromètre de masse. Cette technique permet d’analyser en temps réel les échanges gazeux de différents types de matériels biologiques (microalgues, bactéries, enzymes, etc.). La suspension peut être illuminée soit en lumière blanche amenée par fibre optique, soit en lumière verte par 3 LEDs répartissant uniformément l’éclairement. Le parc se compose d’un analyseur quadripolaire PrismaPlus (Pfeiffer Vacuum) et d’un analyseur à secteur magnétique Prima dB (Thermo Scientific).

Afin de sélectionner les souches d’intérêt, le laboratoire a mis point deux méthodes de criblage. La première discrimine sur la composition en lipides, la deuxième, sur l’activité photosynthétique de l’organisme.

  • Criblage d’une banque de mutants sur la teneur en TAG

  • Criblage d’une banque de mutants sur la composition en acides gras

  • Criblage d’une banque de mutants sur la fluorescence de la chlorophylle

La mesure de la fluorescence de la chlorophylle a été effectuée in vivo à l’aide d’un dispositif d’imagerie vidéo FluorCam FC 800 (Photon Systems Instruments).

 

Ce système de culture fermé permet de contrôler très finement les différents paramètres qui régule la croissance des microalgues, la température, l’intensité lumineuse, le pH, la vitesse d’agitation et le débit de gaz carbonique.

Nous disposons de quatre bioréacteurs autoclavables de volume utile de 1 litre (BIOSTAT® Aplus, Sartorius Stedim Biotech) pour la culture de microalgues. Ce dispositif permet de contrôler les paramètres tels que la température, le pH, la vitesse d’agitation, le débit de gaz de culture et l’intensité lumineuse. 

Une sonde anti débordement et une pompe péristaltique pour l’ajout de milieu permettent des cultures en continu. Le système d’éclairage réalisé au laboratoire permet de réguler l’éclairage entre 30 et 1500 µmol photon/m2/s (PAR). Ces bioréacteurs sont pilotés depuis un ordinateur avec le logiciel PC Panel µDCU.

Pour étudier, in vivo, les paramètres déterminants de l’efficacité de conversion de l’énergie solaire par la photosynthèse, la plate-forme dispose de techniques non invasives de spectroscopie optique

Dual Pam : Ce dispositif reposant sur une lumière d’analyse modulée permet de suivre en temps réel la fluorescence de la chlorophylle du photosystème II et l’absorption du centre réactionnel du photosystème I.
Il permet notamment d’estimer les rendements de conversion de l’énergie lumineuse au niveau de ces deux photosystèmes.

JTS10 (Joliot-type spectrophotometer) : Ce spectromètre mesure les changements d’absorption de pigments et transporteurs d’électrons de la chaîne photosynthétique. La mesure étant effectuée à partir de flashes de l’ordre de la microseconde, il permet une résolution cinétique fine de différents événements de transferts d’électrons contribuant à la photosynthèse.

Les souches conservées à l’EBM

Une collection de près de 500 souches de microalgues et de cyanobactéries, sauvages ou transformées, est conservée dans la cryobanque de l’équipe EBM hébergeant la plateforme Héliobiotec :

  • Mutants d’insertion de Chlamydomonas reinhardtii créés au laboratoire
  • Souches de C. reinhardtii exprimant des gènes d’intérêt à la hausse ou à la baisse
  • Souches mutantes de Synechocystis PCC6803
  • Diverses espèces de microalgues provenant de collections du monde entier (CCAP, UTEX, SAG, Duke Center, etc.)

 

La conservation des souches

La conservation des microalgues se fait par congélation à une température inférieure à -180°C en cryoconservateur dans de l’azote liquide. Ce mode de conservation a été choisi pour éviter les dérives génétiques pouvant se produire à la suite de trop nombreux repiquages sur gélose.

La gestion des souches

Le logiciel LabCollector est utilisé pour la gestion des souches à l’EBM.
Ce logiciel nous permet, entre autres, de gérer deux étapes importantes dans la conservation des souches:

  • La traçabilité des opérations
  • La planification des contrôles périodiques de viabilité

Au moment des contrôles de viabilité, des tests de non-contamination sont aussi effectués.

 

Objectif : Comparer l’évolution des différents gènes d’intérêt pour la production de biocarburants ou de molécules biosourcées pour la chimie verte, la cosmétique, la pharmaceutique et la nutraceutique.

 

​La plateforme HelioBiotec dispose d’un LightCycler 480 (Roche Diagnostics) qui nous permet d’effectuer la quantification des gènes en temps réel.
Il s’agit de la fusion de deux technologies :

  • La PCR: polymérisation en chaîne permettant l’amplification de l’ADN
  • La quantification (relative ou absolue) du signal fluorescent produit

Le but est de comparer l’évolution de différents gènes d’intérêt. Cette comparaison est normalisée par des gènes témoins (stable en toute condition). Les analyses peuvent être effectuées en plaque 96 ou 384 puits.

Cet appareil permet également de faire du génotypage grâce au module HRM (High Resolution Melting). Cette technique peut permettre, par exemple, de séparer 2 populations variantes pour une seule base (acide nucléique) dans un gène donné. Elle combine les mêmes technologies que précédemment mais avec une meilleure résolution.

Responsable et contact de la plateforme

Yonghua LI-BEISSON

Contact

Mots clés

alcanes et alcènes ; glycérolipides: phospholipides ; hydrocarbures ; pigments ; polyesters lipidiques ; cires de plantes ; acides gras dicarboxyliques