Thèmes de recherche

Les bactéries des sols interagissent avec les métaux et radionucléides (RN) et peuvent modifier leur spéciation chimique, modulant ainsi leur mobilité et leur biodisponibilité. Réciproquement, les radionucléides sont des éléments chimio- et radio-toxiques qui peuvent induire un stress cellulaire et contre lesquels certaines espèces présentent des capacités de tolérance élevée. Au niveau environnemental, le rôle des bactéries dans le transfert des RN, en particulier dans le sol et vers les plantes est encore très mal connu. Au niveau cellulaire, les mécanismes moléculaires impliqués dans la détection, le transport, la réponse et la tolérance aux RN ne sont pas encore caractérisés.

Dans ce contexte, nous étudions :

• La réponse cellulaire et les mécanismes de tolérance à l’uranium chez des souches isolées de sols riches en radionucléides par une approche pluridisciplinaire alliant biologie moléculaire, biochimie, génomique, protéomique et biophysique (Gallois et al. J Proteomics 2018)
• Les mécanismes de séquestration des alcalino-terreux (en particulier le calcium et le strontium) par une bactérie photosynthétique et son potentiel en bioremédiation (Mehta et al. 2019, projet HARLEY)
• Le rôle des bactéries dans le transfert de l’uranium aux plantes (projet RADONORM et INSPECT)

Pour les expériences, nous disposons d’un laboratoire dédié à la manipulation de bactéries en présence d’éléments radioactifs (SALTO).

1- TOXICITÉ DES PARTICULES D’OXYDE DE COBALT – FINANCEMENT EDF

L’existence de cas de contamination humaine par inhalation accidentelle de cobalt sous forme d’oxydes radioactifs dans les installations d’EDF justifie la nécessité de recherches sur la toxicité et le comportement de ces particules. Nous avons déjà abordé la toxicité chimique des oxydes de cobalt sur les cellules pulmonaires en utilisant l’isotope stable du cobalt ⁵⁹Co. Même si les effets de l’émetteur ⁶⁰Co ont été largement décrits dans la littérature pour l’irradiation externe, ces effets ne sont pas connus après une contamination interne.

La contamination interne par des particules de ⁶⁰Co entraîne une irradiation chronique et localisée en raison de la rétention à long terme des particules dans l’organisme. Par conséquent, le comportement in vivo des particules de ⁶⁰Co et la conception de décorporants spécifiques représentent un intérêt important tant pour les fabricants de produits nucléaires tels qu’EDF que pour la santé publique. L’objectif de notre projet est d’identifier et de tester in vitro et in vivo des molécules qui augmentent la dissolution des particules de Co pour diminuer la rétention pulmonaire et favoriser l’excrétion du cobalt. Grâce à un criblage approfondi basé sur des études de dissolution d’autres oxydes métalliques, nous avons sélectionné des molécules ayant des propriétés différentes, telles que le potentiel redox et la capacité de chélation, et avons grandement amélioré la dissolution des particules (1). Les travaux en cours sont maintenant axés sur la dissolution dans des modèles cellulaires et sur des études de décorporation in vivo afin d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques.

2- POUSSIÈRES TRITIÉES ET DEMANTELEMENT

 http://transat-h2020.eu/

Lancé en septembre 2017, le projet européen Horizon 2020 TRANSAT (TRANSversal Actions for Tritium) durera 48 mois avec un budget total de près de 4 millions d’euros. Coordonné par le CEA, il rassemble 18 partenaires de 8 pays européens

Lors du démantèlement des installations nucléaires, les opérations visent à enlever ou à éliminer toute matière tritiée. Ces opérations génèrent de fines poussières en suspension dans l’air, à savoir des aérosols. Le workpackage 3 est consacré à l’étude des conséquences d’un rejet de particules d’acier inoxydable et de ciment tritiés en termes de radiotoxicologie et d’écotoxicologie (2). Les résultats prévus dans ce projet aideront les autorités de radioprotection, l’AIEA et d’autres organismes consultatifs en matière de sûreté nucléaire à évaluer plus précisément la radiobiologie, la dosimétrie, la génotoxicologie et l’écotoxicologie des particules tritiées de l’ordre du micron et des sous-microns.

Nous sommes impliqués dans ce projet à deux niveaux :

1/ Animation du workpackage

2/ Etude de la toxicité, de la génotoxicité et du comportement des particules tritiées dans des modèles pulmonaires humains (en collaboration avec l’AMU IMBE)

– Utilisation de deux modèles in vitro : la lignée cellulaire BEAS-2B immortalisée et le modèle cellulaire in vitro 3D de l’épithélium des voies respiratoires humaines MucilAir® pour étudier la contribution du stress chimique et radiologique par l’utilisation de particules tritiées et non tritiées

– Évaluation des effets à court et à long terme et de la réversibilité des effets toxiques après une exposition aiguë

– Évaluation du transfert de tritium à travers la barrière épithéliale pulmonaire en mode cinétique

– Définition du mode des effets cytotoxiques à l’aide d’une combinaison de tests comprenant des tests de cytotoxicité (métabolisme, intégrité épithéliale), clonogéniques (efficacité de clonage) et liés au stress oxydatif (ex : rapport GSH/GSSG).

– Évaluation des dangers génotoxiques par des méthodes de toxicologie génétique standard (essais de comètes et de micronoyaux à l’aide de sondes centromériques/ coloration anticytochore), mesures des modifications épigénétiques (méthylation de l’ADN, profilage de la chromatine, teneur en microARN) pour analyser la régulation de l’ADN, les lésions primaires de l’ADN et les dommages aux chromosomes.

RÉFÉRENCES :

1. Van Der Meeren A, Lemaire D, Coudert S, Drouet G, Benameur M, Gouzerh C, et al. In vitro assessment of cobalt oxide particle dissolution in simulated lung fluids for identification of new decorporating agents. Toxicol In Vitro. 2020;66:104863.
2. Liger K, Grisolia C, Cristescu I, Moreno C, Malard V, Coombs D, et al. Overview of the TRANSAT (TRANSversal Actions for Tritium) project. Fusion Engineering and Design. 2018.

Les radionucléides présents dans l’environnement et certains cations métalliques posent des problèmes de toxicité parfois à grande échelle. Dans l’équipe, nous étudions les déterminants de l’interaction entre cations métalliques et protéines afin de mieux comprendre les mécanismes de toxicité par compétition avec des cations métalliques biologiques ou dans le but de développer des protéines affines et sélectives pour la biodétection ou la bioremédiation de toxiques métalliques.

Ces études impliquent des approches combinées d’ingénierie des protéines et de caractérisation par différentes méthodes, spectroscopie UV-Vis, Fluorescence, calorimétrie, ESI-MS, FTIR.

Les projets en cours concernent

• les propriétés d’interaction de variants du motif EF-hand qui fixe normalement le calcium avec l’uranium¹ ou des lanthanides ainsi que la sélectivité Ca / Sr (projet DEMETERRES)
• les propriétés d’interaction entre plutonium et protéines² (coll. LILA, DEN-Marcoule)
• les propriétés d’interaction avec les alcalino terreux d’une protéine qui pourrait être clé dans la précipitation de ces composés sous forme de carbonates chez les cyanobactéries (ANR Harley, K. Benzerara IMPMC)
• le rôle d’une protéine périplasmique dans l’incorporation de lanthanides chez putida (projet EC2CO Lanthanomics, P. Billard Univ Nancy)
• l’évolution dirigée assistée par des phages pour modifier la sélectivité métallique de protéines impliquées dans la réponse au stress métallique (ANR BioBrickevolver, P. Nicolas MaIAGE, INRAE). Ces protéines pourront servir de base pour développer des biosenseurs de cobalt
  
  

1 Sauge-Merle et al. Chem. Eur. J. 2017, 23, 15505 – 15517
2 Sauge-Merle et al. Dalton Trans. 2017, 46, 1389-1396

A l’IPM, un premier biosenseur fluorescent d’uranyle a été obtenu, basé sur l’ingénierie de sites affins et sélectifs de l’uranyle^1,2,3. Ce biosenseur, inspiré du biosenseur fluorescent de calcium de l’équipe de Tsien (Prix Nobel de chimie en 2008)⁴, est construit sur la base du domaine N-terminal modifié de la calmoduline encadré par deux protéines fluorescentes (GFPs, Figure 1A). La fixation du métal entraine un transfert de fluorescence appelé FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) entre les 2 GFPs, qui donne accès à la quantité de métal fixé (Figure 1B). Les atouts majeurs de cette sonde sont une réponse rapide et ratiométrique, impliquant un résultat indépendant de la quantité de senseur.

Figure 1. Biosenseur fluorescent d’uranyle
A. Fonctionnement du biosenseur. B. Spectres de fluorescence mesurés en présence de Ca²⁺ ou d’UO₂²⁺

Sa caractérisation in vitro a montré une affinité apparente pour l’uranyle de l’ordre du micromolaire, une sélectivité très marquée pour l’uranyle vis-à-vis d’autres cations testés (Ca²⁺, Mg²⁺, K⁺, Na⁺) et une bonne robustesse avec une gamme de travail en pH entre 5 et 7,5.

Ce biosenseur a ensuite été validé in vivo pour la détection d’uranyle dans les racines de la plante modèle Arabidopsis thaliana (Thèse R. Cherif avec article en préparation, collaboration H. Javot (SAVE/BIAM)). L’analyse au microscope confocal de la fluorescence des racines exprimant le biosenseur montre que l’exposition des racines à 10 µM d’uranyle pendant 24H entraine une augmentation significative du FRET en présence d’uranyle. Ce résultat indique que le biosenseur est capable de mesurer un flux d’uranyle entre le milieu de culture et la racine (Figure 2), alors que la fraction d’uranium incorporée dans la racine dans ces conditions est estimée à 1%. Des études cinétiques et de dose-réponse en microfluidique sont en cours pour préciser ce flux d’uranyle.

Figure 2. Effet de l’exposition des racines de plantes à une solution de 10 µM uranyle pendant 24H
Racines observées au microscope confocal. B. Analyses statistiques du traitement des images par Image J et R

Un nouveau projet débute dans le cadre de la thèse de Nicolas Jans et vise à exprimer le biosenseur fluorescent d’uranyle dans des larves de poisson zèbre (Danio rerio) pour la détection en ligne d’uranium biodisponible (collaborations DAM / TEFOR Paris Saclay / IRSN – thèse FOCUSDEM, ECCOREV2020).

Différents projets développés dans l’équipe, allant de l’étude de bactéries environnementales jusqu’à l’ingénierie de protéines et la biologie synthétique, pourraient nourrir à plus ou moins long terme des applications en bioremédiation pour le traitement d’eaux ou d’effluents contaminés aux métaux et RNs.

Ces projets concernent :

• La séquestration de RNs par des bactéries capables de les piéger par biominéralisation. Ces aspects sont développés sur différents modèles bactériens pour l’uranium et le ⁹⁰Sr notamment.
• L’identification et la caractérisation de protéines affines de l’uranium, synthétisées par des bactéries environnementales en réponse au stress uranyle.
• L’ingénierie d’architectures chélatantes permettant la fixation sélective d’un métal ou d’un RN d’intérêt.

  

Plusieurs des thèmes de l’équipe sont alimentés par des approches d’étude des relations structure propriétés des protéines impliquées dans la réponse aux métaux. Les approches de biochimie sont combinées à des approches de biophysique comme la fluorimétrie, la Spectrométrie de Masse en mode dénaturant ou en mode natif préservant les interactions protéine-cofacteur ou la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier.

Ces approches de biophysique sont complémentaires d’approches structurales comme la diffraction de rayons X, pour étudier les propriétés des sites actifs ou les mécanismes enzymatiques. Elles sont dédiées à l’étude de métalloprotéines ou de photoenzymes comme les photosystèmes ou la photodécarboxylase d’acides gras (FAP) en collaboration avec différentes équipes du BIAM.

Etude de relation structure-fonction dans des protéines photosynthétiques par spectroscopie différentielle dans le domaine IR de moyennes et basses fréquences.  

Lidia Zuccarello – 2016 2019

http://www.theses.fr/2019AIXM0107

Réponse cellulaire d’isolats environnementaux de Microbacterium à une exposition à l’uranium.

Nicolas Gallois – 2015 2018

http://www.theses.fr/2019AIXM0107

Analyse de la biodiversité bactérienne d’un sol contaminé de la zone de Tchernobyl et caractérisation de l’interaction engagée par une souche de Microbacterium avec l’uranium.

Nicolas Théodorakopoulos – ​2010 2013

http://www.theses.fr/2013AIXM4108

Optimisation d’un site protéique chélatant l’uranium dérivé de la calmoduline.

Romain Pardoux – 2009 2012

http://www.theses.fr/2012AIXM4116

Analyse et exploitation des populations bactériennes de sols riches en uranium : sélection d’une espèce modèle.

Laure Mondani – ​2007 2010

http://www.theses.fr/2010AIX22113

Étude des interactions protéine-métal par spectroscopie infrarouge dans le domaine des basses fréquences.

Laure Marboutin – 2003 2006

http://www.theses.fr/2006AIX22071